transgenik jati

PENDAHULUAN

Jati (Tectona grandis) adalah adat untuk semenanjung dan India tengah, Myanmar, Indonesia, Thailand, dan Laos, dan juga telah muncul sebagai jenis tanaman kayu utama di sejumlah negara-negara lain di Afrika, Hindia Barat, dan Sri Lanka (Mohanan et al., 1997). Jati yang tumbuh lambat Oleh karena itu spesies, dan peningkatan pohon adalah investasi jangka panjang, tetapi spesies ini mudah didirikan pada perkebunan.
Usia rotasi tradisional tinggi (60-100 tahun) (Kjaer dan Foster, 1996). Penerapan bahan perbaikan akan mengurangi usia rotasi, karena adanya pertumbuhan yang membaik tingkat. Rotasi usia penanaman jati ditanam untuk produk tradisional dapat dikurangi menjadi 40-50 tahun dengan Menggunakan meningkatkan penanaman saham. Namun, 10-15 tahun akan diperlukan dari inisiasi program perbaikan sebelum benih unggul pertama yang tersedia, dan lain 40-50 tahun akan diperlukan sebelum kayu dari rotasi pertama saham penanaman ditingkatkan dipanen (Kjaer dan Foster,1996).

Pohon mengekspresikan Bt transgen mungkin lebih baik untuk penggunaan aplikasi spray untuk beberapa alasan. Pertama, vegetasi, tanah dan air sekitarnya tanaman tidak terkena melayang semprot. Rentan, non-target, serangga di daerah sekitarnya pada tanaman transgenik tidak akan terkena, mengurangi potensial untuk pengembangan resistensi Bt. Kedua, aplikasi spray cepat menurunkan, bertahan pada daun untuk, paling banyak, beberapa hari (Thompson et al, 1995;.. James et al, 1999). Pohon rekayasa genetika, bagaimanapun, dapat menghasilkan toksin terus menerus, sehingga menghindari kepekaan ke aplikasi waktu dan biaya yang berkaitan dengan aplikasi berulang.

Akhirnya, karena pohon transgenik menghasilkan toksin dalam jaringan tanaman, adalah mungkin untuk mempengaruhi serangga yang berada di dalam pabrik, seperti penggerek pucuk daun dan folder. Di Forest Research Institute Malaysia (FRIM) kita memiliki berhasil mengembangkan sistem transformasi untuk jati, menggunakan gus sebagai gen penanda (Norwati et al., 2007). Kami melaporkan produksi tanaman jati transgenik mengekspresikan gen cry1Ab pengkodean Bt-toksin dan efeknya pada Lepidopteran hama, P. damastesalis larva. Kami berharap bahwa baik bahan tanam sehingga dapat diproduksi untuk perkebunan jati.

METODE DAN BAHAN

Bahan nodal segmen tanaman, jaringan target yang digunakan dalam penelitian ini, disediakan oleh Laboratorium Kultur Jaringan, FRIM. Budaya disubkultur pada interval bulanan dengan mentransfer segmen nodal ke hormon bebas media MS (Murashige dan Skoog, 1962). Segmen nodal yang dipertahankan dalam ruang pertumbuhan selama 2 minggu sebelum pemboman (Norwati et al., 2007).

Isolasi DNA Plasmid : The pCAMSB1 plasmid (Norwati dan Abdullah, 1998) membawa gen cry1Ab digunakan dalam semua percobaan transformasi. Ini juga membawa plasmid-Glukuronidase (uidA) dan higromisin phosphotransferase(hpt) sebagai reporter dan gen penanda dipilih, masing-masing. The pCAMSB1 plasmid diisolasi dari bakteri Escherichia coli HB101 menggunakan Kit Persiapan Plasmid (Pharmacia, USA).

Transformasi Biolistic   :  DNA untuk percobaan pemboman diisolasi menggunakan Kit Persiapan Plasmid (Pharmacia, USA). The Biolistic perangkat pengiriman partikel (PDS 1000HE, BioRad) digunakan untuk semua percobaan transformasi. Partikel emas (1,6 m) yang dilapisi dengan DNA (Sanford et al, 1993;.. Walter et al, 1994) dan dibombardir ke dalam jaringan target menggunakan ketentuan sebagai berikut: pecah tekanan disc, 1100 psi, kesenjangan jarak dari disc pecah ke macrocarrier, 6 mm, jarak perjalanan macrocarrier, 16 mm; perjalanan jarak microcarrier, 6 cm.

Isolasi DNA dan RNA   :   Genomic DNA diisolasi dari daun regenerasi tanaman dibombardir (Doyle dan Doyle, 1987), dimurnikan menggunakan PCR Murni Tinggi Template Persiapan Kit (Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, diekstraksi menggunakan Plant RNA Ekstraksi Maxi s-Prep Kit (GeneTACG, Bioscience, USA) dan baik digunakan secara langsung untuk RT-PCR atau disimpan pada -80 º C sampai digunakan.

Analisis PCR : reaksi PCR dilakukan di 1xPCR buffer yang mengandung 1,0 mM dNTP, 2 U Taq DNA polimerase (Roche Diagnostics), 50 pmoles primer dan 100 ng DNA template. Analisis PCR menunjukkan transformasi yang stabil didasarkan pada amplifikasi fragmen 746 bp dari gen cry1Ab.

Membalikkan Rantai Reaksi (RTPCR) : cDNA transcriptase-polymerase disintesis menggunakan RevertAid tersebut ™ Strand Pertama cDNA Sintesis Kit (Fermentas). Untuk pembangunan pertama-untai cDNA dari RNA, yang diinginkanjumlah RNA (biasanya 1 - 5 mg) pertama kali ditambahkan ke oligo-dT primer (0,5 mg / ml) atau primer spesifik untuk cry1Ab gen (15-20 pmol) dan disesuaikan dengan nuklease air bebas deionisasi, dengan volume akhir 12 ml. Campuran itu kemudian didenaturasi pada 70 º C selama 5 menit dan kemudian langsung didinginkan di atas es.

PEMBAHASAN DAN HASIL

Transformasi tanaman dan regenerasi Dalam studi ini, kita berurusan dengan produksi tahan jati transgenic Paliga damastesalis larva. Segmen nodal dari jati dibombardir dengan plasmid rekombinan bernama pCAMSB1. Ini pCAMSB1 plasmid membawa CaMV 35S 5 '/ cry1Ab/nosT 3' kaset ekspresi yang terkait dengan gen hpt untuk seleksi higromisin dan gen gus sebagai gen pelapor (Norwati dan Abdullah, 1998). Untuk membuktikan kehadiran cry1Ab gen, plasmid rekombinan ini telah dicerna dengan berbeda enzim restriksi, dielektroforesis pada 0,8% (b / v) agarose gel dan akhirnya Selatan-dihapuskan ke membran. Hasil dari analisis Southern blot menunjukkan bahwa plasmid rekombinan yang mengandung gen cry1AB dan stabil dalam E. coli HB101 dan selanjutnya dapat ditransfer ke jati menggunakan pendekatan Biolistic.

Pendekatan Biolistic untuk mentransfer gen cry1Ab ke dalam jaringan jati selalu dipengaruhi oleh kombinasi faktor penting termasuk vakum, shock akustik, penetrasi partikel, dampak dan toksisitas, dan kematian sel (Hunold et al., 1994). Banyak faktor-faktor ini khusus untuk eksperimental tertentu set-up, sementara yang lain tampaknya menjadi penting lebih umum. Parameter umum lainnya sehingga meningkatkan kinerja transformasi genetik termasuk pengurangan ukuran partikel agregat dengan menggunakan baffle pasca-peluncuran (Russel et al., 1992a).

 Tabel 1. Kematian larva setelah makan dengan daun jati transgenik dan non transgenik.

Analisis PCR Dan Regenerasi Putatively Berubah Planlet, Sebuah cek langsung untuk kehadiran ditransfer cry1Ab gen dalam planlet putatively berubah dilakukan dengan menggunakan teknik PCR. DNA genomik Terisolasi dari planlet berubah diduga digunakan sebagai PCR Template. Primer untuk gen cry1Ab dirancang untuk memperkuat sebuah fragmen 746bp internal gen cry1Ab. Setelah amplifikasi PCR dan elektroforesis agarosa gel, hanya 64% dari dianalisis transgenik jati positif untuk band 746bp diharapkan, sementara sisanya menunjukkan negative Hasil. Analisis Southern blot dilakukan dengan menggunakan cry1Ab DNA penyelidikan lebih lanjut menegaskan bahwa fragmen 746bp PCR-diperkuat adalah gen cry1Ab. Beberapa teknik yang tersedia untuk mendeteksi ekspresi gen. Ini termasuk analisis blot Utara, dalam hibridisasi in situ dan Reverse Transcriptase Polymerase Chains Reaction (RT-PCR) (William dan Jeffrey, 1995). Dalam analisis RT-PCR, kurang dari 10 salinan DNA target yang diperlukan, dan telah berhasil ketika RNA diisolasi dari satu sel (Razin et al., 1991). Karena tinggi ini  sensitivitas, RT-PCR semakin banyak digunakan untuk mengukur perubahan kecil tapi fisiologis yang relevan dalam ekspresi gen yang seharusnya dapat terdeteksi.

            Uji hayati serangga Dalam bioassay serangga, lima belas baru menetas larva P. damastesalis yang dirilis setiap ke transgenic dan daun jati non-transgenik. Daun transgenik menyebabkan 73-80% kematian larva dan pertumbuhan larva adalah sangat terhambat pada semua daun ini, dan sebagian besar larva mati oleh 5 hari pasca-kutu. Sebaliknya, lebih dari 60% dari larva yang diberi makan daun non-transgenik masih bertahan pada hari kelima, dengan kematian larva 33% diamati keseluruhan (Tabel 1). Kerusakan kecil ke bagian daun dan sangat sedikit skeletonisation (2,7-8%) diamati pada daun transgenik, sedangkan jumlah yang cukup jaringan telah dikonsumsi dalam semua ulangan dari daun non-transgenik yang menunjukkan parah kerusakan lebih dari 30% skeletonisation (Figure 5) oleh larva. Sekitar 57-66 cm2 dari daun non-transgenik menunjukkan skeletonisation, sedangkan hanya 3 cm2 - 6cm2 dari transgenic daun skeletonised. Disimpulkan bahwa daun jati transgenik mengekspresikan gen cry1Ab dilindungi terhadap kerusakan oleh Paliga damastesalis larva.

Figure 5. Bioassay serangga. (a) Daun jati transgenik. (b) Daun non-transgenik jati. Diferences di daerah skeletonization terlihat setelah 5 hari setelah terpapar oleh P. damastesalis larva yang sesuai dengan ekspresi gen cry1AB di daun transgenik.

Figure 6. Selisih ukuran P. damastesalis larva setelah umpan-ing dengan cry1Ab daun berubah (a) dan daun untransformed (b).

Table 2. Daerah Skeletonisation disebabkan oleh P. damastesalis larva pada daun jati transgenik dan non transgenik.

KESIMPULAN

           Berdasarkan uji hayati, kami mampu menunjukkan bahwa teriakan- Gen 1Ab telah berhasil ditransfer melalui Biolistic Metode pemboman dan mengekspresikan toksin dalam sel jati transgenik.